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甲醇营养型巴斯德毕赤酵母的认识

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发布时间:

2014-01-09

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        酵母是单细胞真核微生物,其遗传操作简单,对翻译后的蛋白质有加工修饰的能力,因此在生物技术表达外源蛋白方面是一个很有吸引力的表达系统。与原核表达系统如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等相比,酵母有先进的外源蛋白折叠系统、较强的分泌能力和后加工能力;与动物细胞表达系统相比,酵母可以在简单的合成培养基中生长,并且生长速率快、成本低。酵母表达系统中主要有常规的酿酒酵母和非常规的酵母,后者主要有以甲醇为唯一碳源能源的甲醇营养型酵母和能以乳糖为唯一碳源能源的乳酸克鲁维酵母。我们公司用于发酵生产植酸酶的菌株就是属于甲醇营养型酵母的巴斯德毕赤酵母,该酵母在近年的研究中表现出很广泛的应用前景。

        巴斯德毕赤酵母的生物学特点

        毕赤酵母属的细胞呈短椭圆行或圆柱形,多边芽殖,有些种形成假菌丝,有性繁殖时会形成子囊孢子。巴斯德毕赤酵母是一种可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长的酵母菌,因为其细胞中的过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径的必需酶,如醇氧化酶、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等,其中醇氧化酶(AOX)是甲醇利用途径中的第一个酶,该酶受到葡萄糖、甘油和乙醇等碳源的阻遏。
        甲醇营养型毕赤酵母在以甲醇为唯一碳源生长时,首先甲醇在醇氧化酶的作用下被氧化成甲醛和过氧化氢,然后甲醛被氧化成甲酸,并生成二氧化碳,过氧化氢则在过氧化氢酶的作用下变成水和氧气;另外,生成的甲醛还可以通过木酮糖单磷酸途径被同化成磷酸二羟丙酮和磷酸甘油醛。这两种代谢途径都能为细胞生长提供能量和细胞结构物质。

        甲醇营养型毕赤酵母的优势

        甲醇营养型毕赤酵母与重组酿酒酵母比较具有以下优势:
        (1)具有精确调控的启动子,可以精确表达目的外源蛋白;

        (2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化;

        (3)在简单合成培养基中可实现高密度培养;

        (4)由于该酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,这样就可以极大程度地降低杂菌在发酵液中的繁殖量,减小其对正常发酵的不利影响。因此,甲醇营养型毕赤酵母是近年来作为表达外源目的蛋白最有前途的表达系统。

        外源蛋白在甲醇营养型毕赤酵母中的表达

        毕赤酵母发酵生产外源蛋白的过程一般包括3个阶段:(1)细胞增殖阶段,细胞在含有易利用碳源(如葡萄糖、甘油等)的培养基中快速繁殖以积累生物量;(2)分批流加的过渡阶段,在此阶段中向培养基中限制性流加葡萄糖、甘油等碳源,进一步积累细胞量,为诱导表达做准备;(3)诱导表达阶段,以限制性速率流加甲醇或甲醇与葡萄糖、甘油等的混合液,诱导表达外源目的蛋白。各阶段碳源都为限制性基质,其补加速率的动力学模型是高效表达的基础。

        应用前景及局限性

        巴斯德毕赤酵母表达系统的诸多优势使之越来越受到关注,其研究价值和商业价值亦不断体现。在载体构建和新型菌株的开发方面,已经取得了卓有成效的研究成果。但是作为一种新的表达系统,毕赤酵母也存在一些不足之处,如发酵周期长;利用易燃易爆有毒的甲醇做原料,生产过程和表达产物的卫生安全性需要考虑;筛选高产菌株需用的药物价格比较昂贵,也给生产应用带来局限;另外,表达过程的控制和培养基配方等尚有待于进一步开展开创性的探索研究,突破传统培养发酵模式,优化培养基配方,为提高外源蛋白的表达量作出积极有益的探索。因此还需要对此表达系统做更深入的研究,相信随着对甲醇营养型酵母表达机制的进一步了解,在不久的将来它必将在分子生物学以及工业发酵的各个领域发挥更大的作用。

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