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提高植酸酶热稳定性的技术途径及产品评测方法

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发布时间:

2014-01-08

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制粒是常用的饲料加工工艺,通过制粒改善饲料适口性,提高饲料利用率,保证动物均衡采食营养素和提高生长速度,同时在压制过程中实现高温杀菌。

 

        制粒是常用的饲料加工工艺,通过制粒改善饲料适口性,提高饲料利用率,保证动物均衡采食营养素和提高生长速度,同时在压制过程中实现高温杀菌。在制粒过程中,通常会通入一定压汽,从而使粉料在进入环模制粒前达到较高的温度,即调质过程。粉料温度的测定点一般紧靠在调质器的出口处,这里测定的温度也就是通常所说的制粒温度,理想的制粒温度范围在80-90℃。而实际使用的蒸汽温度则远高于此,湿蒸汽、饱和蒸汽和过热蒸汽的温度分别可以达到100、140和160℃,同时粉料通过制粒机环模后温度也会因摩擦力而增加。此外,蒸汽调质时的高湿环境增强了热能的传递。这些都对饲料中的热敏性因子,如植酸酶产生极大的破坏。

 

       制粒对植酸酶的破坏源于高温对其空间结构的破坏,目前饲料上应用的植酸酶大部分属于酸性磷酸酶家族,其空间上包含两个结构域,因植酸酶的菌种来源不同,其包含的α、β结构数量不一,如无花果曲霉植酸酶的结构是由一个较大的α、β结构域和一个小的α结构域组成,α、β结构域是由5个α螺旋和8个β折叠构成,α结构域是由4个α螺旋组成。而大肠杆菌植酸酶的两个结构域一个是由5个α螺旋和2个β折叠组成,另一个是由6个α螺旋和9个β折叠组成。植酸酶活性部位的氨基酸序列具有高度保守性,其间的氨基酸被修饰或突变后都会导致酶活性的丧失,但高温的影响则在于去折叠效应。

 

        植酸酶目前已通过基因工程微生物发酵实现了大规模廉价生产,而今,生物工程技术也为解决植酸酶的热稳定性提供了很好的途径。同时研究发现,一些分子能通过化学修饰有效提高植酸酶的热稳定性。此外,新型包被技术和包被材料的应用进一步提高了植酸酶热稳定性。

 

        1、生物工程技术设计制造耐热植酸酶菌株

 

        自然界产生植酸酶的微生物多种多样,每种植酸酶的性质各不相同,自然界中存在的烟曲霉、淀粉液化芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等中分离到的植酸酶都能耐受高温,但都在37℃时酶活性极低,缺乏饲用价值(见表1)。  

 

 

来源

最适温度℃

热稳定性

无花果曲霉

58

最高可以耐受65 ℃的高温

烟曲霉

70

100 ℃下加热20 min 后,酶活仅损失10 %

米曲霉

56

65 ℃时酶活损失80 %

淀粉液化芽孢杆菌

60

90 ℃处理10 min 后酶活可保留50 %

地衣芽孢杆菌

65

95 ℃处理15 min 后酶活可保留61 %

枯草芽孢杆菌

55

60 ℃处理1 h,活性减少90 %

       植酸酶的耐热性是受基因控制且可以遗传的。随着基因工程技术及分子生物学技术的发展,蛋白质工程法逐渐成为人们研究蛋白质稳定性的主要手段。目前在蛋白质热稳定性工程中常用的方法为:推理设计、同序概念、杂合酶和定向进化。

 

       推理设计主要是把热稳定蛋白与热不稳定蛋白的氨基酸序列进行比较,分析究竟是哪些氨基酸对蛋白质的热稳定性起关键作用。对耐热与常温植酸酶蛋白的研究发现二者分子量的大小、亚基结构、螺旋程度、极性和活性中心都极相似,但耐热酶蛋白中亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸和精氨酸含量均高于常温菌所产植酸酶,而胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷胺酰胺和天门冬氨酸含量显著低于常温酶蛋白。这是因为脯氨酸结构熵小而易折叠,且一经折叠后则需要很高的能量才能解开,从而提高蛋白质稳定性。谷氨酸和精氨酸分别比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链,侧链所提供的疏水作用及离子间互相作用能提高蛋白质的稳定性。亮氨酸具有较强的疏水性和较大的侧链。目前通过基因定向突变,将植酸酶邻近活性中心的部分氨基酸突变为脯氨酸,已经成功的提高了植酸酶的热稳定性。由于脯氨酸易形成β折叠,从而使构象更稳定牢固,在稳定蛋白质结构和提高酶热稳定性方面具有不可忽视的作用。

 

        同序概念是一种半推理的方法,是对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较,以一定的标准程序计算各氨基酸序列,从中选择对每个氨基酸位点最保守的残基,拼成序列,然后将最后确定的氨基酸序列翻译成相应的碱基序列,最后选用合适的表达系统对这个“人造的”目的基因进行表达。该方法能减少有害突变,也不需要进行高通量的筛选,但设计过程难度较大。

 

        杂合酶技术是把来自不同酶分子的结构单元如二级结构、三级结构或功能域进行组合或交换以产生具有所需要性质的优化酶杂合体结构,组合出新酶。目前已经有技术将土曲霉来源的植酸酶表面的一个二级结构α螺旋用黑曲霉植酸酶上相应长度的一段序列替换,获得了酶活性未变而热稳定性提高的新植酸酶。其原理是因为α螺旋中氨基酸改变导致疏水作用变化,增加了热稳定性。因对杂合的片段相似性要求高,杂合酶技术主要应用于对同源蛋白的稳定性加以改善。

 

        定向进化主要包括多轮随机突变和DNA改组技术。多轮随机突变是以目的基因进行第一轮随机突变,然后筛选出最佳突变子作为下一轮突变的亲本,如此循环下去获得性状优良的突变体。DNA改组技术是指DNA分子的体外重组,通过改变单一或多个基因原有的核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达产物以新功能。实际上是一种分子水平上的定向进化,因此,也称为分子育种。该方法可在短时间内通过重组有效的变异体发掘所有可能的重组体与突变序列,但需要建立有效的试验方法进行筛选。

 

         2、植酸酶分子的化学修饰

 

         酶分子的化学修饰是一种提高酶热稳定性的重要手段。根据X射线对植酸酶晶体衍射结果表明,其分子表面约一半是由疏水氨基酸占据着。从热力学角度看,疏水氨基酸与水分子接触对酶热稳定性不利。因为分子中的氢键在维持酶的空间构象中起着重要的作用,当体系中含有大量的自由水时,就会破坏酶分子内部的氢键,使酶分子构象容易发生变化和变性失活。

 

        金属离子的添加能显著改善酶的热稳定性。可在酶的活性中心含有离子配位体时,通过离子键与其结合稳定酶的构象。此外金属离子还可作为水分子的替代物占据水的位置,排除自由水对酶造成的不稳定化影响。但金属离子对植酸酶的热稳定性的影响比较复杂。研究发现在甲醇酵母植酸酶液中添加CaCl2,80℃处理20分钟后,加入10mmol CaCl2的酶液比加入5mmol CaCl2的相对酶活高约30%。多数研究认为,阴离子的热稳定作用是SO42->Cl- >Br- >NO3-,阳离子是(CH3)4N+>NH4+>K+、Na+>Mg2+>Ca2+>Ba2+。

 

        多羟基化合物既可通过氢键与酶蛋白表面分子相连结,也能通过氢键有效地与外部水分子相连结,使酶蛋白分子稳定,它包括多羟基醇、糖类等化合物。多羟基醇有乙二醇、甘油、甘露醇、木糖醇、山梨醇等,糖类有麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖等。研究糖对植酸酶热稳定性的影响发现,加入甘露醇、葡萄糖、海藻糖均能提高植酸酶在高温下的热稳定性,与不加糖相比,酶活力保留率提高10%左右。有研究发现在植酸酶溶液中加入可溶性淀粉和高粱糖浆废弃液也可以提高植酸酶的热稳定性。其原因可能是高粱糖浆废弃液和淀粉阻止了传热,对酶起到了一定的保护作用。

 

        3、新型包被技术和包被材料

 

        制粒过程中的水分是影响植酸酶热稳定性的一个非常关键的因素。完全干燥的植酸酶的去折叠温度为165℃;当水分增加到12%时,去折叠温度迅速降为95℃;当水分增加到16%时,去折叠温度降为88℃。而包被技术则是将包被材料在物质表面形成一层坚固疏水的薄膜层以提高植酸酶的热耐受能力。

 

        包衣材料的选择很关键,既要求其能耐受高温高湿,又要在消化道能迅速释放发挥作用。植酸酶包衣材料可分为水溶性和脂溶性两类。选用水溶性包衣剂如纤维素可以保证在消化道中能快速溶解和释放植酸酶,但其耐湿能力差。而选用脂溶性包衣剂,如脂肪酸盐则可以更有效地阻止湿热的传递,但包衣需经脂肪酶的作用才能大量释放。目前对包衣材料的选择需选择复合包衣材料,即在脂溶性包衣剂中混合入崩解剂。崩解剂有很强的疏水性,其特点是在一定的pH下能迅速破裂,释放出其包被物质。


        植酸酶包被多数采用多层包被以提高其热稳定性。植酸酶的载体一般选择纤维素、碳酸钙、糊精、淀粉等,经混合、挤压、切割、圆整、低温干燥和筛分,制成含酶小颗粒。然后再采用流化床喷涂氢化牛油、明胶等物质。试验数据显示,植酸酶经包被后在干热的情况下残存酶活性比原酶提高8.7%,而湿热的情况下残存酶活性则提高58.3%。由此可见,采用包被技术提高植酸酶热稳定性的效果明显。

 

         4、植酸酶热稳定性评价方法的研究

 

         最直接的植酸酶热稳定性的评价方法是经过制粒生产来测定其存留率,此外也可以通过实验室的模拟试验来评估。目前,实验室评价温度对植酸酶活性影响的方法主要有三种,即水浴法、干热法和湿热法。

 

        水浴法即通过调节水浴锅中水温和植酸酶溶液水浴时间来评估温度对其活性的影响。此方法简便但因其必需使用植酸酶溶液,其实是已经将酶蛋白直接暴露在高温和高湿环境中,所测存留率要低的多。特别是对采用包被技术的产品,水浴法评估的结果与实际制粒条件下差异非常大。

 

         干热法是将植酸酶在干燥箱里设定一定的温度处理一定时间,测定该温度下植酸酶活性损失。但由于忽视了水分的作用使得测定值偏高。

 

         湿热法在干热法基础上加入湿度因子,使其更接近实际调质和制粒情况。湿热法需先测定植酸酶样品中水分含量,然后据其水分含量均匀添加纯化水调节待处理样品水分至16%,再置于恒温箱中处理一定时间。

 

        湿热法对有效评价制粒过程中植酸酶存留率具有重要的应用价值。通过对实际生产制粒和实验室评估的结果对比发现,水浴法、干热法和湿热法评估结果与实际制粒条件下酶活存留率的相关系数分别是r=-0.62、r=0.09、r=0.97,可见,水浴法评估结果与实际检测结果相关性最差而湿热法能很好地反映实际制粒过程中酶活变化情况,是一种相对有效的实验室植酸酶热稳定性的评价方法。

 

        5、结语

 

        植酸酶对降低饲料成本、减少环境污染和保护生态环境具有重要意义。通过深入研究植酸酶蛋白的结构与热稳定性的关系,对热稳定性基因进行定位和重组,筛选出有效的耐高温菌种,同时综合运用蛋白质热稳定性工程中的各种方法,以及选择合适的酶制剂包被工艺和包被材料,降低植酸酶在饲料制粒过程中的损失,扩大植酸酶的应用范围,更全面的发挥植酸酶的经济效益、社会效益和生态效益。
 

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