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昕大洋复合酶的分子生物学特性

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发布时间:

2013-11-21

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        木聚糖酶、纤维素酶和甘露聚糖酶为昕大洋NSP复合酶中最重要的三种组分。三株单酶菌种均利用自然选择法从特定环境中筛选得到,后经过原生质体复合诱变育种技术,获得耐热耐酸并具有优良抗逆性的高产高效菌株。本文就三种单酶的分子生物学特性进行介绍。
        一、木聚糖酶水解效率高抗逆性强
        昕大洋的木聚糖酶基因xynX,由1484 bp组成,其中包含10个内含子,编码一个由327个氨基酸组成的蛋白质,分子量约为36 kDa,这种高分子量木聚糖酶(>30 kDa)属于F/10族。这一家族的酶除了有内切-1,4-β-木聚糖酶活性外,还包含少量的内切-1,3-β-木聚糖酶活性,对木聚糖的水解速度快,且产物为聚合度1-5 Dp左右的低分子量的寡糖,该族不仅具有木聚糖酶活性,还能作用于一些短链的纤维素底物;而市面上的低分子量木聚糖酶多数属于G/11族,对木聚糖的水解速度慢,产物为聚合度5-10 Dp左右的木寡糖。
        目前,木聚糖酶的应用效果不稳定,原因除了其热稳定性不足之外,还有一个重要的原因就是植物细胞中存在一种对木聚糖酶起抑制作用的蛋白质,在谷物细胞中这种抑制蛋白广泛存在,且分布于谷物的各组织中。研究发现,小麦、燕麦、黑麦、玉米当中都存在木聚糖酶抑制蛋白。 在谷物中小麦所含的抑制蛋白量最高,且在富含糊粉的组分中含量最高,在该组织中的含量是白面粉组分的 4 倍,是富含皮层组分的十倍。为了降低抑制蛋白对木聚糖酶的抑制作用,我们应用化学修饰的实验方法并结合蛋白质结构的模拟计算对木聚糖酶蛋白中的氨基酸残基进行选择性化学修饰。在对蛋白序列中的的谷氨酸和天冬氨酸进行化学修饰的同时保护活性中心的色氨酸不被修饰,从而改变了木聚糖酶与抑制蛋白的结合位点,显著降低了抑制蛋白对酶与底物结合位点的覆盖,保障木聚糖酶分解活性的正常发挥。同时,通过化学修饰使的蛋白序列中的氢键和盐桥数有所增加,进一步提高了木聚糖酶的热稳定性。
        二、甘露聚糖酶作用底物广泛
        不同来源的β-甘露聚糖酶由于产酶生物的种类、生活环境、生存方式等方面的不同在蛋白质结构及功能上存在一定的差异。昕大洋甘露聚糖酶的底物作用范围广,其产生的β-甘露聚糖酶为多分子型,即可产生几种同工酶,并且它们之间有着一定的互补关系。我们从产酶菌株出发,克隆得到甘露聚糖酶的基因序列,该基因包含一个完整的开放阅读框(ORP),编码337个氨基酸,在N端有一个信号肽序列,在阅读框的前面有明显的核糖体结合序列和启动子序列。值得注意的是β-甘露聚糖酶基因开放阅读框能产生不止一种的β-甘露聚糖酶,它们经过了不同的转录、翻译和蛋白加工修饰可产生多分子的甘露聚糖酶。该甘露聚糖酶蛋白包括两个功能结构域,即一个N端甘露聚糖酶催化结构域和一个C端碳水化合物结合域(CBM),其中CBM具有结合并促进纤维素降解的作用,氨基酸序列比对的结果显示该酶与糖苷水解酶家族5的β-甘露聚糖酶同源性较高。利用同源建模的方法对甘露聚糖酶的三维结构进行预测,相关活性位点得到了确认,甘露聚糖酶中的巯基、酪氨酸残基和色氨酸残基是维持酶活性的必需基团,酶的催化域采用一定的折叠方式形成TIM桶状结构,且两个半胱氨酸残基之间形成二硫键,因此该酶具体较高的热稳定性。
        三、纤维素酶结构稳定不易变性
        纤维素酶是将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一组复杂酶系的总称,包括:内切葡聚糖(EG)酶,外切葡聚糖酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)。纤维素的完全水解,是这三种酶的协同作用,内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端,释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生葡萄糖分子。
        纤维素酶具有两个独立的活性结构域: 具有催化功能的催化域(CD)和具有结合纤维素功能的纤维素结合域(CBD) 。CBD在纤维素酶中位于氨基端或羧基端,它通过一段高度糖基化的连接桥与 CD 相连。CBD使纤维素酶结合于纤维素表面,使得临近的 CD 易于接近底物,促进底物的水解。从产酶菌株出发,分别克隆得到三个纤维素酶基因:Bg-1,CBH-2,和EG-3,它们所编码的蛋白分别由425,370和460个氨基酸组成,分别属于糖基水解酶家族1,9和7。每个氨基酸序列中均含有多个N端糖基化位点,蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N端酰基化位点、糖基水解酶家族的N端特征序列以及纤维素结合域。糖基化可增加蛋白质对各种变性条件(变性剂、热等)的稳定性,防止蛋白质相互聚集,同时可覆盖蛋白质分子中的某些蛋白酶降解位点,从而增加蛋白质对于蛋白酶的抗性,蛋白表面的糖链也可提高蛋白质的可溶性。磷酸化和酰基化可进一步改变蛋白质的多肽结构和稳定性,对蛋白结构的稳定以及酶活的保持和激活有一定作用。因此,昕大洋纤维素酶无需后加工处理即具有高稳定性和高耐受性。
        昕大洋木聚糖酶、纤维素酶和甘露聚糖酶的产酶菌株经过合理的筛选以及优良的选育后获得,具有产酶能力强且高效安全的特性。从基因序列及分子结构分析中,发现三种酶的具有水解效率高、抗逆性强、高耐受性且结构稳定等特点,因此特别适合在动物饲料中的应用。昕大洋NSP酶可有效补充动物内源酶的不足,消除饲料中的抗营养因子,加大非常规原料的用量,提高饲料消化率,提高动物养殖效益,促进畜牧业的可持续发展。

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