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植酸酶生化特性研究进展

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admin

来源:

昕大洋

发布时间:

2014-01-09

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        植酸是谷物、豆类、油籽和坚果中磷的主要贮存形式,其含量在1~5%左右。动物饲料中总磷的1/3是可消化的无机磷,其余的2/3则以有机磷的形式存在。单胃动物(如猪、禽)由于其胃肠道内不分泌或只分泌很少量的降解植酸的酶――植酸酶,故不能消化利用植酸磷。植酸酶的研究和生产为单胃动物充分利用饲料中的磷资源开辟了新的途径,显著降低了饲料成本,同时大大减少了畜禽粪便对生态环境造成的磷污染。近年来,随着植酸酶研究的不断深入和分子生物技术的迅猛发展,人们对植酸酶生化特性的认识也越来越深刻。鉴于此,本文对植酸酶生化特性的最新研究进展进行了综述。
 

        1. 植酸酶的分类

        生物化学命名联合会(JCBN)列出了两类植酸酶:即肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(EC 3.1.3.8)和肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(EC 3.1.3.26)。在近期的撰文中,Mullaney和Ullah按照结构和催化特性把植酸酶分为三类,包括组氨酸酸性磷酸酶(HAPs)、β-螺旋植酸酶(BPP)和紫色酸性磷酸酶(PAP)。

        2. 植酸酶的生化特性

        植酸酶是一种酯水解酶,不同来源的植酸酶,其分子量约为35~700 kDa,活性pH值范围通常为4.5~6.0。
 

        2.1 提纯与特性
        黑曲霉 NRRL 3135植酸酶(即phyA、phyB和最适pH为6.0的酸性磷酸酶)属于分泌蛋白,在缺乏磷的淀粉培养基上,它们的分泌量相对较高。这些蛋白的提纯谱表明总分泌蛋白的50%为phyA、phyB和最适pH为6.0的酸性磷酸酶。分泌的糖蛋白在5℃可稳定保存几个月,且缺乏固有的蛋白酶活性,这样就容许在室温下利用离子交换层析和层析聚焦法对其进行纯化。由于它们的糖基化不同,因此这些蛋白被证明是微生物异源蛋白。phyA,phyB和最适pH为6.0的酸性磷酸酶单体的分子量分别约为85、65和85 kDa。通过分析真菌植酸酶对肌醇6-,5-,4-,3-磷酸的Kcat/Km值,发现肌醇六磷酸是phyA和phyB的最适底物,因此将它们归为植酸酶。Casey和Walsh通过离子交换、凝胶过滤和层析聚焦提纯并鉴定了来自黑曲霉 ATCC 9142的植酸酶,它是一种耐热的胞外酶,该酶的 最适温度为65℃,最适pH为5.0,具有较宽的底物特异性,与市场上的植酸酶相比,在80℃表现出更高的热稳定性。
        Kerovuo等提纯了来自枯草芽胞杆菌 VTT E-68013的植酸酶(phyC),其最适温度为55℃,最适pH为7.0。提纯后的酶是一种金属离子依赖性酶,因为其稳定性和活性的发挥均需钙离子的参与。Kerovuo等也研究了枯草芽胞杆菌植酸酶的金属离子需要,发现用EDTA去除金属离子后酶完全失活,再用钙孵育后可部分复活。通过圆二色法推测,酶失活的原因可能是分子构象发生了变化。Golovan等提纯了来自大肠杆菌的植酸酶,分子量为45 kDa,利用层析聚焦法将其进一步分为同样大小的两种异构体,等电点分别为6.5和6.3。异构体表现出相似的最适温度和pH,即60℃和pH 4.5。Stahl等把大肠杆菌appA基因克隆到紫青紫链霉菌中,并将其与在巴斯德毕赤酵母中表达的基因相比,他们发现非糖基化植酸酶的耐热性在45和55℃,比糖基化的植酸酶高,但在65和75℃又分别低80%和94%。
        Tambe等从来自产气克雷伯氏菌的植酸酶中分离出两种异构体,它们的分子量、等电点、Km、热稳定性、最适pH和温度均不相同。据报道这是第一例保留了全部植酸酶活性的分子量仅为10~13 kDa的小片段植酸酶。Segueilha等用柱层析法从卡斯许旺酵母产生的植酸酶中提纯了一种490 kDa的四聚体植酸酶(大亚基为125 kDa,其它三个相同的小亚基为70 kDa),此酶的最适温度为77℃,最适pH为4.4,能使植酸盐完全脱磷。来自丁香假单胞菌MOK1的植酸酶(EC 3.1.3.8)用阴阳离子交换层析法提纯后,在40℃和pH 5.5表现出最大活性和较强的底物特异性。Kim等对来自布氏柠檬酸杆菌的胞内植酸酶进行了12,800倍的纯化,使其达到同质化,其活性为3457 U/mg,这比以前报道的大肠杆菌植酸酶的活性高1.9倍。
总的说来,植酸酶在50~70℃表现出较高的活性,其最适温度多在45~60℃之间。
        2.1.1 催化特性
        当植酸酶完全降解植酸后最终释放出肌醇和正磷酸,其中间产物有单-,2-,3-,4-和5-肌醇酯。因此,植酸酶的活性测定可通过检测正磷酸或低级肌醇磷酸盐的量来进行。通常用比色法测定无机磷,其要从无机溶剂中提取生成的磷钼酸盐。最近,反相C18 HPLC法被用来进行植酸或低级肌醇磷酸盐的分离和定量测定。植酸酶的活性单位被定义为每秒每毫升释放出的磷的纳摩尔数(nkat/s)。在检测条件下,植酸酶对植酸具有很高的特异性,利用这一特性可以将其与酸性磷酸酶区分开来,因酸性磷酸酶是不能降解植酸盐的。为了研究植酸酶氨基酸序列的自然变异以及它们对其催化活性的影响,Brugger等克隆并超量表达了来自六个新烟曲霉隔离种群的植酸酶基因。在所有蛋白中,来自烟曲霉变体的植酸酶更具变异性(86%的氨基酸序列同源性),其比活更高,并具有明显不同的催化特征。
        2.1.2 动力学和底物选择
对植酸盐脱磷酸的动力学参数已进行了广泛的研究。植酸的米氏常数(Km)在17 μM(香蒲植酸酶)到91μM(玉米植酸酶)范围内变化,无花果曲霉植酸酶的米氏常数为40 μM。尽管植酸酶对植酸是相当特异的,但其底物特异性会因分子特征不同而有所变化。一般情况下,酶的水解率符合经典米-曼氏动力学,即磷的释放依赖于底物浓度。通常情况下都认为无机磷酸盐会抑制植酸盐的水解(竞争性抑制),而在特定条件下,当植酸盐浓度高于1.2 mM时会发生底物抑制。Ullah和Sethumadhavan对无花果曲霉和枸杞孢伏革菌 (PL)的植酸酶phyA进行了提纯和定性研究,发现二聚体PL植酸酶比AF植酸酶短26个残基,AF植酸酶是一种单体蛋白。虽然在58 ℃和pH 5.0条件下,PL植酸酶(22,000 nkat/mg)比AF植酸酶(3000 nkat/mg)表现出更高的比活性,但AF植酸酶比PL植酸酶的耐热性好(65 ℃)。尽管两者的活性位点相似,但其转换数、最适pH及在高温和碱性条件下的稳定性却明显不同,这表明它们适于在不同的环境下对植酸酶进行降解,这是由不同的进化历程导致的。
        2.1.3 低级肌醇六磷酸盐异构体的探测
        对肌醇磷酸盐进行有效分析是很困难的,因为它们不吸收可见光和紫外光,也不能用特定的比色试剂进行识别鉴定。通常用氯化铁作沉淀剂来测定这些化合物,然而,这种方法是不充分的,并且缺乏鉴别各种异构体所需的特异性。随着离子偶HPLC方法的发展,才使对肌醇六磷酸盐水解产物的研究成为可能,但这些方法也不能区分肌醇磷酸盐的各种异构体形式,因为梯度洗脱不能进行RI的探测。Mayr针对聚阴离子发展了一种新的以染料络合和过渡金属为基础的后柱探测系统,称作“金属-染料探测”,这种方法可在皮摩尔数量级上对多磷酸非放射性化合物进行异构体选择性测定。同时各种各样的肌醇磷酸盐(包括所有的四个五磷酸盐和四个四磷酸盐)可用梯度离子层析结合后柱衍生法进行确定。据报道,有人通过带有RI探测器的反相C18柱HPLC法检测了肌醇和肌醇磷酸盐。然而遗留问题是如何从各种肌醇磷酸盐(IP1-IP6)中分离出各种异构体。Skoglund等发展了一种灵敏的高性能离子色谱法(HPIC)用于各种异构体(IP1-IP6)的分离和定量测定,该方法利用了带有梯度洗脱的高性能离子交换柱,通过后柱反应或化学抑制电导法进行探测。
   

        2.2 固定化研究
        植酸酶按顺序作用于肌醇六磷酸盐释放出各种低级异构体。因此,一个有效的固定化生物反应器不但能释放金属离子和蛋白等,还可产生各种植酸异构体。Quan等将克鲁斯假丝酵母细胞固定在海藻酸钙胶粒中来制备各种肌醇磷酸盐,并用离子交换色谱将纯异构体分离出来,通过NMR(核磁共振)分析,除了肌醇五磷酸之外,他们得到了其它各种肌醇磷酸的单一异构体。Gautam等以无花果曲霉和少孢根霉为发酵菌种,利用聚苯乙烯作惰性固体载体,在pH 6.0、30 ℃和水分58.3%的条件下进行固体发酵产出胞外植酸酶。Ullah和Cummins通过将黑曲霉 NRRL 3135 phyA植酸酶共价固定在Fractogel TSK HW-75F上构建了一种填充床生物反应器。尽管最适pH未见发生变化,但最适温度却由58℃升至65℃ ,对植酸盐的Km值也升高了,并使磷的释放高出50%。在生物反应器中使植酸盐反复水解之后,用HPLC对产品进行分析,在洗出液中仅探测到了肌醇磷酸和肌醇二磷酸。据观察,当通过蛋白质主链对植酸酶进行固定化时,植酸酶的活性和生物反应器的产量都有所降低。这可能由于在酶与蛋白基质进行广泛交联时植酸酶活性中心发生扭曲的缘故。由于天然植酸酶已被严重糖基化,所以阻止广泛交联是困难的。通过位点直接突变,有可能去除糖基化的残基,从而产生的植酸酶能被部分碳水化合物固定并保持高活性。Greiner和Konietzny通过将大肠杆菌植酸酶共价固定在NHS活化Sepharose 上,提高了其耐热性。Liu等把无花果曲霉植酸酶的最适温度提高到58℃,比自由状态的植酸酶高8℃,这是通过将酶固定在明胶中并用甲醛硬化实现的,其表观Km提高到3.28 mM(自由酶:Km=2.34 mM),酶的剩余活性仅为34.6%。
 

        2.3 植酸酶工程研究
        热稳定性酶的工业重要性正日益提高,因此,除了研究酶的热稳定性之外,酶的分离、定性和酶工程也都成了当前研究的热点。热稳定性是酶成功应用于动物饲料中的先决条件,因为要经受60~90℃的制粒过程。故旨在提高植酸酶在各种条件下催化活性的酶工程设计将产生巨大效益。Tomschy等通过合理诱变改变了植酸酶(烟曲霉和共有序列植酸酶)的pH活性曲线,使之更适合于植酸酶在动物饲料工业中的应用。Lehmann等利用一种新奇的共有序列方法提高了真菌植酸酶的固有耐热性,经过对来自六种不同真菌的13种植酸酶进行序列比较研究以及对每个残基的最保守位置进行选择,重新构建了共有序列植酸酶,其热稳定性得到了提高。之后,他们又纳入了另外六个植酸酶序列的共有氨基酸序列,并通过位点直接诱变研究了38种氨基酸的取代作用。在共有植酸酶序列中引入稳定化的氨基酸提高了植酸酶-1和植酸酶-10的伸展温度,这一做法证明利用共有序列概念对蛋白质进行改造来提高其热稳定性是有效的。

        3. 展望

        虽然报道了相当数量的可产生植酸酶的微生物,但应看到,对具有宽泛底物特异性和高比活的热稳定及酸稳定的植酸酶仍然是非常期待的,这种植酸酶应用于动物营养领域将具有巨大的商业价值。

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