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植酸酶的耐热性

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作者:

admin

来源:

昕大洋

发布时间:

2014-01-08

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植酸酶作为饲料添加剂,主要用于提高单胃动物对饲料中植酸磷等物质的利用率,降低磷的排放量,已经获得了广泛的认可。但在推广应用中还存在一些问题,较为突出的是植酸酶的热稳定性问题。饲料生产的制粒过程需要经过高温加热,一般在75℃~80℃,同时为了杀死沙门氏菌,有时温度高达90℃~95℃,植酸酶在这样的温度下很容易失去部分活力,甚至完全失活。在中国,颗粒饲料约占饲料总产量的70%,所以获得高热稳定性的植酸

        植酸酶作为饲料添加剂,主要用于提高单胃动物对饲料中植酸磷等物质的利用率,降低磷的排放量,已经获得了广泛的认可。但在推广应用中还存在一些问题,较为突出的是植酸酶的热稳定性问题。饲料生产的制粒过程需要经过高温加热,一般在75℃~80℃,同时为了杀死沙门氏菌,有时温度高达90℃~95℃,植酸酶在这样的温度下很容易失去部分活力,甚至完全失活。在中国,颗粒饲料约占饲料总产量的70%,所以获得高热稳定性的植酸酶是近年来植酸酶工业的研究热点和难点。

        现有的部分植酸酶的最适温度和热稳定性见表1。植酸酶制剂的热稳定性与植酸酶本身的热稳定性密切相关,但大部分热稳定性好的植酸酶的最适酶促反应温度也偏高,而最适酶促温度接近40℃的植酸酶则热稳定性较差,所以目前的研究工作是寻找更高耐热性且最适酶促温度接近40℃的优质植酸酶,以促进植酸酶的普遍推广使用。

表1  部分植酸酶的最适温度及热稳定性

1  部分植酸酶的最适温度及热稳定性

 

来源

最适温度

热稳定性

A . ficuum2NRRL3135

58

在没有稳定剂存在的条件下,最高可以耐受65℃的高温

Aspergillus f umigatus

70

100℃下加热20min后,酶活仅损失10%

A . niger N25

60

 

Aspergillus Oryzae M105

56

65℃时酶活性丧失80%

Thermomyces lanuginosus

65

热变性温度75℃

Penicillium Canescens

60

 

Bacillus Subtilis

55

60℃1小时,活性减少90%;60℃2小时,活性全部丧失

玉米Zea mays

55

 

番茄

45

50℃以下,活性保留80%;60℃以下,活性很快丧失

 

        酶对温度的敏感性不但与酶蛋白分子本身的结构有关,也与酶的浓度、纯度、有无底物和保护剂的存在、介质的pH值、离子强度等一系列条件有关。提高植酸酶热稳定性的主要途径就是从这些方面入手的。

        一、改变植酸酶分子结构提高耐热性

        1、酶分子的生物修饰——糖基化修饰

        真核生物的蛋白质合成有复杂的翻译后修饰过程,对蛋白质产物的性能有重要作用。由于翻译后修饰的细微差异,同菌种同基因,不同分离菌株中表达产物的性质也会出现一些差异。

        翻译后修饰中最主要的是糖基化修饰。糖基化修饰一般会提高重组酶的分子量,最佳酶促反应温度变化很小,但可以大幅度提高该酶的热稳定性。例如,设计新的表达载体使phyA基因在Saccharomyces cerevisiae中表达,由于S . cerevisiae表达系统的高度糖基化作用,重组酶的分子量达到120kD,比天然表达的phyA的分子量大50% 。重组酶的最适酶促反应温度55℃~60℃,比原酶的范围更宽,未完全纯化的重组酶在55℃与80℃下分别作用15min之后,酶活分别保留95%和75% ,而同样条件作用后的商品酶PhyA酶活保留分别为72 %和51% 。该重组phyA经去糖基化后,分子量变为50kD,酶活只降低了9%,但酶的热稳定性大为降低,80℃加热15min,酶活损失40%。该例说明糖基化程度对该酶热稳定性的重要影响。

        2、定点突变技术

        Rodriguez等对E. coli pH215 酸性磷酸酶进行定点突变,用天冬氨酸替代酶蛋白多肽链中的几个氨基酸残基,增加酶分子潜在的糖基化位点的数目。突变体基因在P. pastoris 中表达,得到了糖基化程度、酶活性及热稳定性改变很大的突变体植酸酶。近年来的研究也表明,单一氨基酸的替换可以改变酶蛋白的热稳定性,尤其是Pro残基对改善热稳定性的作用尤为显著,可以作为植酸酶蛋白改造的一个思路。

        3、一致性技术

        “一致性技术(consensus technique)”用于创造新的植酸酶分子。其方法是将已知的PhyA的氨基酸序列放在一起比较,借助计算机的帮助,从中选择对每一个氨基酸位点最保守的残基,拼成序列,然后将最后确定的氨基酸序列翻译成相应的DNA序列,再选用合适的表达系统对这个“人造的”目的基因进行表达。

        2002年,Lehmann等在13个植酸酶序列的基础上,增加6个植酸酶的序列进行一致性技术构造,得到的新酶phyA210比以前得到的phyA21的热稳定性提高了7.4℃。对phyA210中4个不稳定性氨基酸进行回复突变,并且引入一个新的稳定性氨基酸残基,使phyA210的热稳定性从85.4℃进一步提高到90.4 ℃。通过定点突变逐个检测每个氨基酸残基对热稳定性提高的贡献,结果发现交换的38个残基中每一个氨基酸残基单独对热稳定性的贡献都小于3℃,整体上热稳定性的提高是这些对该蛋白有稳定作用的氨基酸共同作用的结果。

        4、替换二级结构

        Jermutus等按照耐热性niger植酸酶的晶体结构,将Aspergillus A . terreus 植酸酶表面的一个二级结构α-螺旋用A .niger 植酸酶上相应长度的一段序列替换,获得了酶活性未变而热稳定性提高的新植酸酶。尽管新酶中只有A . niger 植酸酶31个氨基酸序列,但新酶的热稳定性与A . niger 植酸酶相似。说明这种热稳定性一定程度上是该二级结构作用的结果。相对于随机突变的大量筛选而言,该方法省去了筛选的繁重工作。

       二、改变植酸酶的环境条件提高植酸酶的耐热性

        1、植酸酶的固定化

        固定化酶广泛应用于生产和研究领域,可以大大提高酶的稳定性。已有研究人员在尝试植酸酶的固定化应用,用来制备肌醇多磷酸的系列化合物。以植酸酶为标志酶,还发展出了通用于真菌来源的酶的新的固定化技术。固定化植酸酶的稳定性和重复利用性大为提高,是植酸酶利用的方向之一。

        2、缓冲液和保护剂

        在热处理中所使用的缓冲液可以调节酶的热稳定性。重组表达的A . f umigatus 植酸酶经高温处理后,在10mmol/L和200mmol/L的醋酸钠溶液中比在柠檬酸溶液中的残留酶活性可以高20%~39%。另外,保护剂的添加也会大大增加酶的热稳定性,例如甘油、蔗糖、乙二醇溶液和无机盐类等

        3、包衣技术

        将成型后的颗粒植酸酶采用包衣剂,在表面形成一层坚固的薄膜,使植酸酶颗粒与外界隔离,避免制粒时的湿热条件破坏植酸酶分子结构,使植酸酶活性降低或完全失活。该薄膜要求在胃液中溶解释放出植酸酶分子。若使用多种包衣剂,通过多次包衣形成多层薄膜,会进一步提高植酸酶的热稳定性。

        三、植酸酶耐热性的评价

        关于植酸酶产品耐温性评价方法,基本是四种方法。冯定远等(2008)研究结果表明,湿热法与实际调质制粒对植酸酶处理结果具有最强的相关关系(r=0.97),湿热法是最适宜的快捷评价植酸酶耐热性的实验室方法。该文献评价方法总结见下表:

表2    植酸酶产品耐温性评定方法

 

方法

耐热条件

温度℃

与实际制粒相关系数r

缓冲液水浴法

吐温20乙酸缓冲液水浴10分钟

70、80、90

-0.62

干热法

恒温烘箱热空气加热10分钟

70、80、90

0.09

湿热法

补水到16%恒温烘箱热空气加热10分钟

70、80、90

0.97

实际制粒

实际调质后制粒

80

  

        由于恒温烘箱的不同高度、不同位置温度差达到2~3℃,试验结果平行误差较大。水浴锅中不同位置的温度差一般不超过0.1~0.2℃,同时目前实际制粒一般调质水分到18%,所以我们采用将待测植酸酶样品补加水分到18%后用铝箔袋密封,采用水浴加热到待测温度,所得到的结果平行误差较小。由于相同温度下,水浴热量传递速度和强度远远高于热空气气浴热量传递速度和强度,即使水浴5分钟,对植酸酶活性破坏力也远大于热空气气浴10分钟。

        所以,我们将湿热法调整为补充水分到18%,铝箔袋密封后,在待测温度下水浴加热5分钟。该方法评价植酸酶热稳定性更加合理。

        四、昕大洋公司植酸酶产品的热稳定性

        通过多年大量的研发工作,通过基因重组、糖基化修饰、固定化技术和复合包衣技术等一系列技术的应用,北京昕大洋科技发展有限公司植酸酶的热稳定性获得了重大突破,新型耐高温植酸酶颗粒产品95℃湿热法酶活存留率达到90%以上,甚至100℃湿热法酶活存留率也可以达到70%以上,该技术居于行业先进水平。

       五、未来发展趋势

        虽然在提高植酸酶的热稳定性方面已经取得了很大的进步,但植酸酶的应用研究并非仅限于热稳定性,提高酶的综合性能才是今后发展的关键所在。人们在提高植酸酶的活性,增加它对蛋白酶的抵抗性,获得最适宜的pH性质等方面也已经做了很多工作,并取得了丰硕的成果,今后在这些方面一定会有更多突破,使植酸酶有更广泛的应用。

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